جداسازی، همسانه سازی و بیان توالی جزیی ژن آمیلاز در باکتری بومی exiguobacterium sp. sh3

بیش از 30 درصد از آنزیم های تولید شده در دنیا متعلق به خانواده آمیلازها است. در صنایع مختلفی مانند نساجی، صنایع هیدرولیز نشاسته، تولید شربت های شیرین و غیره، آنزیم آمیلاز نقش کلیدی دارد. از آنجا که بهینه دمای فعالیت آمیلازهای موجود در صنعت معمولا بالا است و بالا بردن دما جهت رسیدن به دمای بهینه فرایندی انرژی خواه است، لذا استفاده از آمیلازهای سرمادوست در صنعت رو به افزایش است. هدف اصلی این تحقیق پیدا کردن منبع ژنی آمیلاز جدید از باکتری کمتر شناخته شده بومی ایران است. برای این منظور باکتری اگزیگواباکتریوم sp. sh3 انتخاب شد. این باکتری برای اولین بار توسط پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری جداسازی و ثبت شده است. برای پیدا کردن ژن آمیلاز از این باکتری سرمادوست، از تکنیک های ساخت کتابخانه ژنی و انجام واکنش زنجیره پلیمراز به وسیله آغازگرهای لغزشی استفاده شد. طی این تحقیق تکنیک دقیق ساخت کتابخانه ژنومی برای این باکتری ارائه گردید. همچنین با استفاده از آغازگرهای لغزشی توالی جزیی ژن آمیلاز این باکتری جداسازی شد. برای بیان این توالی جزیی از ناقل پلاسمیدی pqe استفاده شد. همچنین پس از دست یابی به توالی کامل، همسانه سازی ژن مورد مطالعه در ناقل pet 26b انجام شد. پس از القای بیان و با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل، پروتئین نوترکیب خالص سازی شد. آزمون های بیوشیمیایی نمایان نمود که ph بهینه برای فعالیت این آنزیم 5/6 است. همچنین km و vm این آنزیم به ترتیب برابر 264165/0 و 52833/0 محاسبه شد. در پایان مدل سه بعدی این آنزیم به روش های تشخیص فولد و مدل مخفی مارکوو شبیه سازی شد و به وسیله موتاسیون مجازی و داک گذاری سعی گردید تا تمایل مدل سه بعدی آمیلاز به نشاسته افزایش یابد. این تحقیق پیشنهاد می کند که با اعمال موتاسیون های مجازی عنوان شده در شرایط آزمایشگاه می توان به آنزیم فعال تری دست پیدا کرد.